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利用生物3D打印技术制备复合SA/Ge组织工程支架

更新时间: 2019-12-06 09:46:03  查看次数: 302    
利用生物3D打印技术,首先考察实验仪器参数对组织支架结构以及孔径的影响,然后在制备好的支架上接种软骨细胞来研究中药淫羊藿苷对促进软骨细胞增殖、分泌的影响。通过实验的研究,证实生物3D打印制备组织工程支架行之有效,而且中药淫羊藿苷能够促进软骨细胞增殖、保持支架上细胞的软骨性能,从而为实现体外构建组织工程提供了新的方式。


首先,考察仪器参数对制备SA/Ge组织支架精确度的影响。以2g海藻酸钠和6g明胶作为打印基材,制备出的复合凝胶呈现透明状、粘度适中且材料的流体性能良好。打印气压对支架的精确度影响结果表明,随着打印气压的逐渐增大,支架的结构清晰度和规整度逐渐增加,在0.30Mpa达到最优值;打印速度对支架的影响结果表明,16mm/s是最适合的制备支架的打印速度,过快或过慢都会导致支架结构完整性和孔洞贯通性下降;打印针头对支架的影响结果表明,随着打印针头直径的增大,打印支架所需的压力降低、打印速度加快,制备过程效率提高;从打印间距对支架影响的结果可以得出,间距的加大有助于使得制备出支架的结构规整、孔孔贯通性良好。


其次,对制备出的SA/Ge复合凝胶支架的性能进行简单的研究。支架的热稳定性实验表明,复合支架相比纯海藻酸钠支架具有更好的稳定性能,有助于支架保持完整结构;溶胀率实验结果表明,在4hSA/Ge复合凝胶支架的溶胀率达到最大值713%,短时间快速使固体支架溶胀成水凝胶支架有利于细胞在支架上的粘附和生长;从复合支架的降解实验结果得出,CaCl2对海藻酸钠交联度较低且主要交联支架的外部结构,当其外部结构在摇床晃动情况下被分解后,内部结构短时间内开始大量降解;对支架的浸提液做毒性分析,DMSO作为阴性对照对细胞具有明显的毒性,而支架浸提液与正常培养基相比没有显著性差异,表明制备出的支架安全无毒。


然后,对实验所使用的C5.18(大鼠前成软骨细胞系)的生长特性以及功能特性进行研究和分析,并且研究淫羊藿苷梯度浓度是否对平面培养的软骨细胞具有促进增殖和分泌作用。体外培养C5.18细胞,从生长曲线可以发现它是一种快速增殖的细胞,光镜观察发现细胞呈三角形或多角形。对培养的C5.18细胞进行组织学染色,结果表明实验选用的C5.18细胞具有软骨细胞的特性;淫羊藿苷对软骨细胞的作用表明,0.1-100μg/mL的ICA对软骨细胞增殖和分泌都有一定的促进作用,但10μg/mL的促进作用更加明显,MTT实验结果和GAG分泌结果数据相互印证。


最后,将软骨细胞接种在复合支架上,观察细胞生长和分泌状况。通过SEM观察细胞接种不同时间段后在支架上的粘附情况,接种在支架1h后的细胞呈现圆球状,细胞没有伸展出形态;3h细胞形态逐渐伸展,出现“伪足”;5h大量细胞完全舒展开来,展现出细胞的不规则多边形形状;7h时完全舒展开来的细胞与细胞之间相互作用并连接起来,形成细胞团聚体。利用CLSM观察细胞在支架上的分布状况和死活情况,细胞大部分分布在支架的褶皱里和孔洞里,在支架表面上分布的细胞量很少。死活实验结果表明,随着层厚的加深细胞数量明显大量减少,培养三天后观察发现支架上的细胞呈现出一定量的死亡现象。梯度ICA作用支架上的软骨细胞,由MTT实验和GAG分泌检测情况表明,在0.1-100μg/mL浓度范围内能够促进软骨细胞的增殖、分泌,10μg/mLICA的促进效果更加显著,100μg/mL相比其它梯度组特别是10μg/mL组抑制了细胞的增殖。


综上所述,通过生物3D打印技术制备获得了结构规整、孔洞贯通性良好的复合SA/Ge组织工程支架,仪器参数控制在气压0.30MPa、速度16mm/s时是最优的制备参数。支架性能研究,制备的复合支架热稳定性更好、无毒,短时间达到溶胀平衡更加有利于细胞粘附和生长。接种在支架上的软骨细胞粘附、生长良好。梯度ICA培养细胞/支架复合物发现在0.1-100μg/mL范围内促进软骨细胞增殖和分泌GAG,10μg/mL促进效果达到更佳,100μg/mL过高反而相比抑制了细胞的增殖、分泌。



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